細(xì)胞凋亡
一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞凋亡或稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取1塊24孔板，接種指數(shù)生長(zhǎng)期目的細(xì)胞：100000個(gè)/孔，設(shè)置NC對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，3復(fù)孔/組；
2. 細(xì)胞接種24h后，更換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基500ul（含2%FBS）；
3. 取lipofilter約2.4ul，以RPMI1640培養(yǎng)基（含2%FBS）47.6ul混勻，室溫靜置5min；
4. 取制備的siRNA約50pmol（2ul），以RPMI1640培養(yǎng)基（含2%FBS）46ul混勻；
5. 將步驟3與4準(zhǔn)備的2管溶液混合，輕輕混勻，室溫靜置20min后加入步驟b的細(xì)胞中；
6. 培養(yǎng)6h后，更換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基（含10%FBS）500ul，繼續(xù)培養(yǎng)；
7. 培養(yǎng)72h后，300g，4℃，離心5min；
8. 以預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，并300g，4℃，離心5min；
9. 棄PBS，加入100ul的1*Binding buffer重懸細(xì)胞；
10. 加入5ul的Annexin V-FITC和10ulPI Staining Solution，輕輕混勻；
11. 避光，室溫反應(yīng)10-15min；
12. 加入400ul 1*Binding Buffer，混勻后放置于冰上，在1h以?xún)?nèi)流式檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
1. 整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。
FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示例圖
上一篇：細(xì)胞周期
下一篇：沒(méi)有了
下一篇：沒(méi)有了
