MTT實(shí)驗(yàn)
MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。
MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、接種細(xì)胞：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。
2、培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。
3、呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul。繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
4、比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
三、注意事項(xiàng)
1、選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度
2、避免血清干擾：一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液
3、設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零
4、MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！
MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖
MTT檢測(cè)細(xì)胞毒性
