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CHIP

CHIP及ChIP-seq實(shí)驗(yàn)服務(wù)

染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是用于研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。CHIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。通過對(duì)ChIP富集得到的DNA片段進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序（ChiP-seq），可獲得數(shù)百萬條序列標(biāo)簽，并能把所關(guān)注的蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)精確定位到基因組上。ChiP-seq具有背景低、信噪比高、定位精度高、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)。

一、CHIP實(shí)驗(yàn)流程

1. 交聯(lián)固定：配置1% PBS甲醛，然后將10ml的1%甲醛加入到樣本中；室溫?fù)u床慢搖10min,用500 ul 2.5M 甘氨酸中止固定，繼續(xù)慢搖5 min;然后300g,5min離心。

2. 取細(xì)胞核：棄培養(yǎng)液，用大量冰預(yù)冷的PBS洗3遍，每一遍洗完后300g,5min離心，最后棄上清保留固定過的樣本，用1ml IP dilution buffer重懸；

3. 染色質(zhì)片段化：樣品轉(zhuǎn)到2ml EP管，冰上超聲：20次，30s on/30s off;13200rpm,10min ,4度，收集上清，留取50ul用作In put備用；

4. 孵育：將上清分成兩份，一份加入IgG抗體，一份加入目的蛋白抗體，然后4度孵育過夜；在孵育好的抗體-超聲裂解物中加入 Protein G beads,然后4度孵育4小時(shí)；

5. 洗脫：使用Wash buffer wash Beads 4次后，使用Elution buffer進(jìn)行洗脫；在洗脫產(chǎn)物中加入蛋白酶K,65度消化過夜；

6. 純化：用QIAquick PCR Purification Kit 純化樣品；

7. CHIP-qPCR檢測(cè)：設(shè)計(jì)引物，通過qPCR進(jìn)行目標(biāo)基因的定量檢測(cè)。

CHIP-qPCR示例圖

二、CHIP-seq實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析

（一）CHIP-seq實(shí)驗(yàn)過程

CHIP實(shí)驗(yàn)獲得的DNA樣品進(jìn)行建庫，上機(jī)測(cè)序。

本研究使用 Diagenode 公司 MicroPlex Library Preparation Kit v2 為例，進(jìn)行ChIP-seq 建庫，具體操作步驟如下：

1. 樣本質(zhì)檢：在建庫之前需要對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)。使用 Life 公司 Qbit 定量試劑盒對(duì) ChIP 得到的 DNA 樣本進(jìn)行定量。然后使用安捷倫公司 2100DNA 電泳儀對(duì)微量的 DNA 進(jìn)行片段大小確認(rèn)。（要求 DNA 含量>0.5 ng/μL,片段分布在 100-600 bp 之間）

2. 末端修復(fù)、磷酸化并加dA尾：取5μL ChIP得到的dsDNA,加入2μL Template

Preparation buffer 及 1μL Template Preparation Enzyme.混勻后放入 PCR 儀中。22°C25 分鐘，55°C20 分鐘，4°C2 分鐘。

3. 接頭連接：在樣本中加入1μL Library Synthesis Buffer及1μL Library Synthesis Enzyme.混勻后放入 PCR 儀中。22°C40 分鐘，4°C2 分鐘。

4. PCR 擴(kuò)增：在樣本中加入 25μL Library Amplification Buffer、1μL Library Amplification Enzyme 及 4μL Nuclease-free Water.混勻后放入 PCR 儀器中。

5. PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化

a. 前取出 AMPure XP beads 放置于室溫，渦旋震蕩混勻。

b. 在樣本中加入 50μL （1X） AMPure XP beads,使用移液器混勻。

c. 室溫孵育 5 分鐘。

d. 將混合樣本短暫離心（不超過 500 rpm）并置于磁力架中。待溶液澄清后（約 8 分鐘），小心移除上清。

e. 保持離心管始終處于磁力架中，加入 300μL 新鮮配制的 80%乙醇。室溫孵育 30 秒，小心移除上清。重復(fù)此步驟兩次。

f. 將離心管放于 37°C 金屬浴中，開蓋干燥磁珠 2 分鐘。

g.加入 25μL Nuclease-free Water 進(jìn)行 DNA 洗脫。渦旋振蕩使充分混勻。將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中。待溶液澄清后（大約 8 分鐘），小心吸取 22μL 上清至滅菌 PCR 管中。即得 DNA 文庫。